Os produtos naturais possuem alto grau de diversidade química, o que os torna mais atrativos na busca por novos fármacos. A família Myrtaceae é uma das mais importantes da América do Sul, e no Brasil distribui-se por todas as regiões do país. O gênero Myrcia inclui arbustos e árvores pequenas, e seus compostos não voláteis isolados são normalmente descritos por atividades hipoglicemiantes, anti-hemorrágicas e antioxidantes. A espécie Myrcia splendens é conhecida popularmente por “guamirim-de-folha-miúda”, e sua ocorrência vai desde o México até o Sul do Brasil. As doenças infecciosas e a resistência microbiana tornaram a pesquisa por novas moléculas, uma necessidade global, sendo os compostos de origem natural uma fonte promissora para essa busca. Desta forma, o objetivo principal deste trabalho foi pesquisar metabólitos secundários presentes nos extratos e nas frações da espécie Myrcia splendens com potencial atividade antibacteriana. Para isso, as folhas da espécie foram coletadas, secas, moídas e maceradas em etanol 70% (EBH), acetato de etila (EBAE) e diclorometano (EBDM). Uma parte do EBH foi posteriormente fracionado através de partição líquido/líquido, resultando nas frações acetato de etila (FAE), diclorometano (FDM) e aquosa (FAq). Testes colorimétricos foram realizados na busca por classes de metabólitos secundários presentes nos três extratos, onde, o EBH apresentou a maior quantidade de classes detectadas, dentre estas os fenóis e taninos, flavononóis, catequinas, triterpenóides e saponinas. A identificação e quantificação de compostos fenólicos foi realizada por HPLC-ESI-MS/MS, sendo ao total foram identificados 15 compostos fenólicos: ácido siríngico, ácido p-cumárico, ácido salicílico, isoquercetina, ácido elágico, ácido ferúlico, umbeliferona, coniferaldeído, sinapaldeído, carnosol, ácido gálico, siringaldeído, coniferaldeído, miricetina e kaempferol. Na avaliação da atividade antimicrobiana por microdiluição em caldo, frente a bactérias com parede celular Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Escherichia coli (ATCC 25922), as amostras EBH, FAE e FAq mostraram atividade antibacteriana moderada para S. aureus; frente P. aeruginosa todas as amostras, exceto FDM, apresentaram atividade moderada; as amostras EBAE e FAE apresentaram atividade moderada frente a bactéria E. coli. No ensaio de avaliação da interação entre os extratos e a gentamicina, através do método de Checkerboard, as amostras EBH, FAE, FDM e FAq demonstraram antagonismo frente S. aureus; frente E. coli as amostras EBDM e FAE também apresentaram antagonismo, e a amostra EBAE foi indiferente; frente a bactéria P. aeruginosa as amostras FAE, FDM e FAq apresentaram antagonismo, EBH mostrou-se indiferente, EBAE aditivo e EBDM apresentou sinergismo. Todas as relações avaliadas neste teste referem-se ao uso concomitante à gentamicina. No método de avaliação do crescimento bacteriano versus tempo (método de Time-Kill), o extrato que melhor inibiu o crescimento bacteriano foi o EBDM frente a bactéria P. aeruginosa, inibição observada a partir do momento inicial do contato entre o extrato e a bactéria. Os resultados obtidos e os que estão em andamento contribuem para compreensão do potencial antibacteriano e da composição química da espécie M. splendens, e surgem como alternativa promissora na busca de novos fármacos.